Cell | 增强Prime Editing基因编辑效果的新思路:细胞内源因子筛选

BioArt 2021-10-15 02:09
撰文 | 木兰之枻

责编 | 兮


引导编辑(prime editing,PE是David Liu实验室新开发的精准基因编辑系统:在PE向导RNA(pegRNAs)的引导下,逆转录酶MMLV与nCas9组成的融合蛋白可实现四种碱基之间的自由替换,以及目标位点碱基的精准插入与删除(详见BioArt报道:专家点评Nature | David Liu再出重磅基因编辑新工具,可实现碱基随意转换与增删【1】。绝大多数致病遗传变异都是碱基点突变及插入缺失突变【2】,因此引导编辑在临床基因治疗研究中极具潜力。不过目前引导编辑研究仍处于起步阶段,其编辑效率偏低,且影响因素不明,极大的限制了其应用。为提升PE的基因编辑效率,研究者对pegRNAs进行了系统性改造并取得良好效果(详见BioArt报道:Nat Biotechnol | 刘如谦团队改造Prime editing向导RNA(pegRNAs)有效提升精准编辑效率【3】。不过PE基因编辑系统依然有很大的提升空间,值得深入探索。


2021年10月14日,美国哈佛大学David Liu实验室与普林斯顿大学Britt Adamso实验室合作在Cell杂志上发表了题为Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes的论文。文章借助CRISPRi筛选,对影响引导编辑(PE)编辑效果的细胞内源性因子进行了系统分析,发现抑制DNA错配修复(MMR)通路可有效增强PE基因编辑的效率和准确性。研究者还通过优化PE系统融合蛋白的整体结构进一步提升了PE的基因编辑效果。



细胞内的DNA修复机制对引导编辑(PE)有重要影响,但具体机制及关键因子依然有待探究。研究者将CRISPRi筛选和PE系统有机结合,并借助一种新的筛选策略Repair-seq,对影响PE基因编辑效果的内源性因子进行了系统分析。筛选结果显示,抑制DNA错配修复MMR通路的关键因子如MSH2,MSH6, MLH1和PMS2能有效增强PE的编辑效率。研究还发现,MMR通路对PE基因编辑中出现的多种错误编辑事件也有影响:抑制MMR通路在一定程度上会降低PE2(nCas9-MMLV+pegRNA)基因编辑的准确性,但能有效提高PE3(nCas9-MMLV+pegRNA+nicking sgRNA)基因编辑的准确性。随后,研究者还通过RNAi实验和MMR通路缺失的HAP1细胞进一步证实,抑制MMR通路有助于改善PE系统的编辑效果。


因为siRNA无法快速起效,同时转染靶向MLH1的siRNA和PE2表达载体难以增强基因编辑效率。不过研究者发现,共转MLH1的ATP酶失活型突变体E34A或内切核酸酶失活型突变体可以有效增强PE系统的基因编辑效率,其中MLH1 dn(Δ754-756)和MLHNTD(NTD:1-335)-NLS效果最好。之后研究者将PE2与MLH1 dn的组合称为PE4,将PE3与MLH1 dn的组合称为PE5。研究者还系统评估了MLH dn对不同类型突变的编辑效率的影响。结果显示,MLH dn能增强所有12种点突变的编辑效率,但对G-C突变的增强效果最差。此外,MLH dn对<15bp的插入缺失突变有明显的增强,但对更长片段的插入缺失突变并无很好的增强。


研究还发现,多点突变(>2)编辑能避开MMR修复通路,从而有效增强PE系统的基因编辑效果:诱导特定点突变的同时在相邻位点引入同义突变,可有效增强PE介导的基因编辑效率,但这种效率的增强很难再被MLH1 dn提升。


之后研究者对MLH dn在不同细胞系的效果进行分析,发现MLH dn在MMR通路活化的细胞系中对PE基因编辑的增强效果更加明显。研究还指出,MLH dn能有效降低PE5编辑过程中错误的编辑事件以及pegRNA骨架在编辑位点的整合,对PE编辑过程中的脱靶风险也无明显影响。虽然MMR修复通路会影响基因组微卫星不稳定性,但MLH dn瞬时表达对此并无明显影响。


为进一步提升PE系统的基因编辑效率,研究者还对PE系统中nCas9-MMLV融合蛋白的结构进行了优化。通过优化MMLV逆转录酶的密码子,在nCas9与MMLV融合位点间添加长度为34个氨基酸的衔接序列(包含SV40 NLS),在融合蛋白C末端增加c-Myc的NLS序列,以及在nCas9中引入R221K和N394K突变,研究者构建出具有更强编辑效果的PEmax。而将PEmax与改造后的pegRNAs(epegRNAs)以及MLH1 dn合用,可以最大幅度的提升PE基因编辑的效率和准确度。文章最后,研究者还在HEK293T细胞、iPSC细胞以及原代T细胞中通过质粒转染和mRNA电转染等策略证实了PE4和PE5用于疾病治疗的有效性。


总体而言,本研究对影响引导编辑(PE)基因编辑效果的内源性因子进行了系统性筛选,发现了DNA错配修复通路(MMR)在其中的关键作用。研究指出,MMR通路关键因子MLH1的显性负性突变体(MLH1 dn)能有效增强PE的基因编辑效率。而对PE系统融合蛋白的结构进行优化也能明显提升PE编辑效率。本研究最终开发出的PE升级版本PE4/PE4max以及PE5/PE5max为疾病的基因治疗提供了更加强大的工具。


原文链接
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.018


制版人:十一



参考文献


1.  Anzalone, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149–157 (2019)

2. Rees, H.A. & Liu, D.R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet (2018).

3.  Nelson, J.W., Randolph, P.B., Shen, S.P., Everette, K.A., Chen, P.J., Anzalone, A.V., Newby, G.A., An, M., Chen, J.C., and Liu, D.R. Engineered pegRNAs that improve prime editing efficiency. Nat. Biotechnol. (2021).

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